کروماتوگرافی (Chromatography)

کروماتوگرافی بر اصول کل پخش فاز  بنیان نهاده شده است. به طور خلاصه، در این روش جریان یک فاز از کنار (یا از داخل) فاز ساکنی میگذرد و در این حال فاز ساکن اجزای آنرا به طور انتخابی خارج میکند. این خروج یک عمل تعادلی است و مولکولهای اجزاء دوباره داخل فاز متحرک میشوند. هنگامی که ثابت پخش دو یا چند جزء در این دو فاز با هم متفاوت باشند، اجزای مربوط در فاز متحرک از هم تفکیک میشوند. به طور ساده میتوان گفت که هر چه فاز ساکن یک جزء را محكمتر نگه دارد، در صد مولکولهای جزئی که بی حرکت نگه داشته شده بیشتر میشود. جزء دیگری که با شدت کمتر نگه داشته میشود نسبت به جزء اول در فاز متحرک درصد مولکولی بیشتری خواهد داشت. بنابراین به طور متوسط مولکولهای جزئی که با شدت کمتر نگه داشته میشوند، نسبت به مولکولهای دیگر با سرعت بیشتری از روی فاز ساکن میگذرند (در جهت جریان) و در نتیجه اجزای مربوط به قسمتهای مختلف فاز ساکن (باندها) منتقل میشوند.

فاصله باندها به طور خطی به مسافتی که در ستون طی میشود بستگی دارد. به طور کلی هر چه مسافت طی شده بیشتر باشد، فاصله باندها زیادتر خواهد شد. یادآور میشود که اجزای مخلوط باید ضرایب پخش متفاوتی داشته باشند تا بتوان آنها را به کمک پخش فاز تفکیک کرد. در صورتی که این ضرایب به هم نزدیک باشند، اجزای مربوط فقط به طور جزئی به باندهای جداگانه تفکیک میشوند. البته میتوان طول مسیر را زیاد کرد و به اجزاء فرصت داد تا بیشتر از هم جدا شوند.

کروماتوگرافی چهار نوع مهم دارد که بر اصول توصیف شده بالا متکی هستند. این انواع عبارتند از:

کروماتوگرافی گازی (کروماتوگرافی تفکیکی گاز مایع) (Gas Chromatography)

کروماتوگرافی ستونی (Column Chromatography)

کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography) (TLC)

کروماتوگرافی کاغذی(Paper Chromatography).

كروماتوگرافي ستوني (Column Chromatography)

 

در كروماتوگرافي ستوني جسم بين فازهاى مايع و جامد پخش ميشود. فاز ساكن جسم جامدي است و اين جسم اجزاي مايعي را كه از آن ميگذرد به طور انتخابي در سطح خود جذب ميكند و آنها را جدا ميكند. اثرهايي كه باعث جذب سطحي ميشوند همان اثرهايي هستند كه موجب جذب در مولكولها ميشوند. اين اثرها عبارتند از: جاذبه الكترواستاتيكي، ايجاد كمپلكس، پيوند هيدروژني، نيروي واندروالس و غيره.

براي جدا كردن يك مخلوط با كروماتوگرافي ستوني، ستون را با جسم جامد فعالي (فاز ساكن) مانند آلومينا يا سيليكاژل پر ميكنند و كمي از نمونه مايع را روي آن ميگذارند. نمونه ابتدا در بالاي ستون جذب ميشود. سپس حلال استخراج كننده اي را در داخل ستون جريان ميدهند. اين فاز مايع متحرك، اجزاي مخلوط را با خود ميبرد. ولي به علت نيروي جاذبه انتخابي فاز جامد، اجزاي مربوط ميتوانند با سرعتهاي مختلفي به طرف پايين ستون حركت كنند. تركيبي كه با نيروي كمتري جذب فاز ساكن شود سريعتر خارج ميشود زيرا كه درصد مولكولي آن در فاز متحرك از تركيبي كه با نيروي زيادتري جذب فاز ساكن ميشود بيشتر است.

 

 

اجزاي تفكيك شده را ميتوان مجددا به دو روش به دست آورد:

1) مواد جامد ستون را ميتوان خارج كرد و قسمتي از آنرا كه حاوي باند مورد نظر است بريد و با حلال مناسب استخراج كرد.

2) چون باندها با زمانهاي مختلفي خارج ميشوند ميتوان آنقدر حلال را از ستون عبور داد تا باندها از انتهاي آن خارج شوند و در ظرف جداگانه اي بريزند.

معمولا روش دوم كاربرد بيشتري دارد.

در مورد اجسام رنگين ميتوان باندهايي را كه به طرف پايين ستون مي آيند مستقيما مشاهده كرد.

 

 

 

 اما در مورد اجسام بيرنگ نميتوان تغييرات را مستقيما مشاهده كرد. با اين حال بسياري از اجسام در هنگام تابش نور ماوراي بنفش فلوئورسانس پيدا ميكنند و در چنين مواردي از اين خاصيت جهت مشاهده باندها استفاده ميشود. معمولا براي پي بردن به جريان عمل كروماتوگرافي ستوني حجمهاي كوچك و ثابتي (مثلا 25 ميلي ليتر) از محلول استخراج شده را جمع آوري ميكنند. سپس حلال آنها را تبخير ميكنند تا ببينند جسمي در آنها وجود دارد يا خير. گرچه ممكن است يك جسم در چند ظرف پخش شود، ولي اگر حجم هر جزء نسبتا كم گرفته شود (مثلا كمتر از 10% حجم ستون) معمولا باندهاي مختلف در ظروف مختلف جمع آوري ميشوند. روش ديگري كه براي پي بردن به وضع تفكيك مناسب آن است كه محلول استخراج شده در فاصله زماني مختلف با كروماتوگرافي لايه نازك مورد بررسي قرار گيرد.

تعدادي از جاذبهاي جامدي كه عموما مصرف ميشوند عبارتند از: آلومينا، سيليكاژل، فلورسين، زغال چوب، منيزيم اكسيد، كلسيم كربنات، نشاسته و شكر. معمولا شيميدانهاي آلي از آلومينا، سيليكاژل و فلورسين بيشتر استفاده ميكنند.

آلومينا (Al₂O₃) تركيب قطبي بسيار فعالي است كه قدرت جذب زيادي دارد و به سه صورت موجود است: خنثي، شسته شده با اسيد و شسته شده با باز. آلوميناي بازي براي تركيبهاي اسيدي و آلوميناي اسيدي براي تركيبهاي بازي قدرت تفكيك خوبي نشان ميدهد. در تركيبهايي كه به شرايط اسيدي و بازي حساسيت دارند و واكنش شيميايي دارند بايد از آلوميناي خنثي استفاده كرد. آلومينا با قطبيت زيادي كه دارد تركيبهاي قطبي را به شدت جذب ميكند و در نتيجه ممكن است استخراج آنها از ستون را مشكل كند. فعاليت (قدرت جذب) آلومينا را ميتوان با افزايش كمي آب كاهش داد، درجه فعاليت آلومينا با درصد وزني آب موجود مشخص ميشود. سيليكاژل و فلورسين هم قطبي هستند ولي قطبيت آنها از آلومينا كمتر است.

براي اينكه جاذبهاي جامد نيروي موثرتري داشته باشند، بايد اندازه ذرات آنها يكنواخت و سطح مخصوص آنها زياد باشد. چنين سطحي باعث تسريع تعادل جسم در دو فاز ميشود. اين حالت در ايجاد باندهاي باريك اهميت دارد.

در تعيين شرايط يك تجربه كروماتوگرافي بايد به ماهيت فاز مايع (حلال) مصرفي توجه كرد. حلال نيز ميتواند در جسم جامد جذب شود و به اين وسيله براي جذب مواضع جذبي كه در سطح جامد وجود دارند، با جسم حل شده رقابت كند. چنانچه حلال قطبي تر باشد و شديدتر از اجزاي مخلوط جذب شود، تقريبا تمام اجزاء در فاز مايع متحرك باقي ميمانند و تفكيكي كه در ضمن تجربه صورت ميگيرد ناچيز خواهد بود. در نتيجه براي اين كه تفكيك خوب انجام شود بايد قطبيت حلال استخراجي به طور قابل ملاحظه اي كمتر از اجزاي مخلوط باشد. به علاوه بايد اجزاي مخلوط در حلال حل شوند، زيرا در غير اين صورت اجزا به طور دايم در فاز ساكن ستون جذب ميشوند و در آن باقي ميمانند. قدرت استخراجي حلالهاي مختلف (يعني توانايي آنها در انتقال يك جسم معين به پايين ستون) بترتيب زير از بالا به پايين زياد ميشود:

هگزان

كربن تترا كلريد

تولوئن

بنزن

دي كلرومتان

كلروفرم

دی اتيل اتر

اتيل استات

استون

پروپانول

اتانول

متانول

آب

در يك كروماتوگرافي ستوني ساده نمونه را در بالاي ستون ميگذارند و در طول تفكيك از حلال واحدي استفاده ميكنند. بهترين حلال انتخابي، حلالي است كه بيشترين فاصله را در باندها ايجاد كند. چون احتمالا بهترين حلال در اثر تجربه بدست مي آيد، گاهي راحتتر است كه در انتخاب حلال براي كروماتوگرافي ستوني از روش كروماتوگرافي لايه نازك استفاده شود. تعداد زيادي از تجربه هاي كروماتوگرافي لايه نازك را ميتوان با استفاده از حلالهاي مختلف، در زمان نسبتا كوتاهي انجام داد. معمولا بهترين حلال يا مخلوط حلالي كه به اين روش به دست مي آيد براي كروماتوگرافي ستوني مناسب است.

معمولا از روشي كه به استخراج تدريجي (يا جزء به جزء) معروف است استفاده ميشود. در اين روش براي ظهور كروماتوگرام از يك سري حلالهايي استفاده ميكنند كه قطبيت آنها مرتبا رو به افزايش ميرود. در شروع با يك حلال غير قطبي (معمولا هگزان) ممكن است يك باند به طرف پايين ستون حركت كند و از آن خارج شود و در اين حال باندهاي ديگر در نزديكي ابتداي ستون باقي بمانند. سپس حلالي كه قطبيت آن اندكي بيشتر است به كار ميبرند. در حالت ايده آل بايد يك باند ديگر خارج شود و در اين حال بقيه باندها در عقب آن باقي بمانند. چنانچه قطبيت حلال يكباره زياد بالا رود، ممكن است تمام باندهايي كه باقي مانده اند يكباره از ستون خارج شوند. بنابر اين بايد در هر مرحله قطبيت حلال به مقدار كم و با قاعده معيني افزايش يابد. بهترين راه انجام اين كار آن است كه از حلالهاي مخلوط استفاده شود و تعويض كامل حلال چندان مناسب نسيت.

طريقه پر كردن ستون بسيار اهميت دارد زيرا ستوني كه خوب پر نشود اجزاء را هم خوب تفكيك نميكند. جسم پرشده بايد همگن باشد و در آن هواي محبوس يا حباب بخار وجود نداشته باشد.

 

آماده سازي ستون كروماتوگرافي

يك بورت 50 ميلي ليتري را در حالت عمودي به گيره اي ببنديد. شير بورت بايد بسته و چرب نشده باشد. بورت را با اتر نفت (60-30 درجه ) تا نزديكي درجه 40 ميلي ليتري آن پر كنيد و به كمك يك لوله شيشه اي طويل كمي پشم شيشه را به انتهاي بورت فرو بريد. درون بروت به حدي شن بريزيد تا ارتفاع 1 سانتي متري بالاي پشم شيشه را بپوشاند. پس از خروج كامل حبابهاي درون شن، در حالي كه به آرامي به ديواره بورت ضربه ميزنيد 15 گرم آلومينا را به داخل لوله بريزيد. هنگام پايين رفتن آلومينا ستون را تكان دهيد. اين اعمال به پر شدن يكنواخت ستون كمك ميكنند. جدار داخلي بورت را كه آلومينا به آن چسبيده با اتر نفت اضافي بشوييد. براي محافظت از آلوميناي پر شده يك لايه 1 سانتي متري شن در بالاي ستون قرار دهيد. شير بورت را باز كنيد و بگذاريد تا حلال خارج شود و درست به بالاي لايه شن بالايي برسد. حال ستون براي قرار دادن نمونه مخلوط مورد تفكيك آماده است.

 

کروماتوگرافی لایه نازک(Thin Layer Chromatography) (TLC)

کروماتوگرافی لایه نازک نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع است و اصول آن مانند کروماتوگرافی ستونی است. ولی در این مورد جسم جاذب جامد را به صورت یک لایه نازک در روی یک قطعه شیشه یا پلاستیک محکم پخش میکنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه میگذارند و صفحه را همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در ظرفی قرار میدهند. مقدار حلال باید آنقدر باشد که فقط به سطح زیر لکه برسد (شکل الف). حلال به طرف بالای صفحه میرود و اجزاء مخلوط را با سرعتهای متفاوت با خود میبرد. در نتیجه ممکن است تعدادی لکه روی صفحه ظاهر شود. این لکه ها روی یک خط عمود بر سطح حلال ظرف قرار میگیرند (شکل ب).

 

 

 

این روش کروماتوگرافی بسیار آسان است و به سرعت هم انجام میشود. این روش برای تفکیک اجزاء یک مخلوط بسیار مفید است و همچنین میتوان از آن برای تعیین بهترین حلال استخراج کننده جهت کروماتوگرافی ستونی استفاده کرد.

در TLC میتوان از همان مواد جامد که در کروماتوگرافی ستونی استفاده میشود استفاده کرد و در این میان سیلیکا و آلومینا بیشتر به کار میرود. معمولا جسم جاذب را با مقدار کمی از ماده نگهدارنده مانند گچ شکسته بندی، کلسیم سولفات و یا نشاسته مخلوط میکنند تا جسم جاذب چسبندگی لازم را پیدا کند و به صفحه بچسبد. صفحه ها را میتوان قبل از مصرف تهیه کرد و یا از ورقه های پلاستیکی آماده که در بازار موجود است استفاده نمود.

یکی از مزایای مشخص TLC آن است که احتیاج به مقدار بسیار کمی از نمونه دارد. در بعضی موار میتوان تا مقدار ^9-10 گرم را تشخیص داد. اما ممکن است اندازه نمونه تا 500 میکرو گرم برسد. در نمونه های زیاد میتوان از تجربه های تهیه ای استفاده کرد. در این تجربه ها لکه های مختلف را میتراشند و با یک حلال مناسب میشویند (استخراج میکنند). و برای شناسایی (از طریق طیف سنجی) به کار میبرند.

تشخیص لکه های رنگین در روی کروماتوگرام آسان است و برای تعیین محل لکه های اجسام بیرنگ روشهای متعددی وجود دارد. برای مثال میتوان با تابش نور ماوراء بنفش به صفحه محل لکه، ترکیبهایی را که خاصیت فلوئورسانس دارند مشخص کرد. به روش دیگر میتوان جسم جاذب را با ماده فلوئورسانس دار بی اثر دیگری مخلوط کرد. هنگامی که نور ماوراء بنفش به این صفحه بتابد، لکه اجسامی که نور ماورای بنفش را جذب مي‌کنند ولی خاصیت فلوئورسانس ندارند در زمینه فلورسانس دار صفحه به صورت تیره رنگ ظاهر میشوند. در بسیاری موارد دیگر، از معرفهای آشکارساز دیگری استفاده میکنند. این معرفها را میتوان بر روی کروماتوگرام پاشید و لکه ها را ظاهر کرد. سولفوریک اسید، که بسیاری از ترکیبات آلی را به ذغال تبدیل میکند و محلول پتاسیم پرمنگنات نمونه هایی از معرفهای آشکار ساز هستند که به این روش مصرف میشوند. ید نیز معرف آشکار ساز دیگری است که مصرف میشود. در این مورد صفحه را در ظرفی میگذارند که محیط آن از بخار ید اشباع باشد. بسیاری از ترکیبات آلی ید را جذب میکنند و لکه آنها روی کروماتوگرام رنگین (معمولا قهوه ای) میشود.

در شرایط معین سرعت حرکت ترکیب نسبت به سرعت پیشرفت حلال (R_f) خاصیت مشخصی از ترکیب است. برای تعیین این مقدار مسافتی را که جسم از خط شروع تا وسط لکه را طی کرده است اندازه میگیرند و آنرا به مسافتی که حلال پیموده تقسیم میکنند. این مسافت را با خط شروع یکسانی میسنجند.

 

 

 

بخش عملی

تفکیک مواد رنگی برگ سبز

چند میلی لیتر از مخلوط 2 به یک اتر نفت و اتانول را همراه با چند برگ سبز در هاونی بگذارید و برگها را با دسته هاون له کنید. مایع بدست آمده را به یک قیف جدا کننده منتقل کنید و همان حجم آب مقطر به آن اضافه کنید و تکان دهید. فاز آبی پایینی را دور بریزید. این شستشو را دو بار انجام دهید و هر بار فاز آبی را دور بریزید. و آب تازه اضافه کنید.لایه آلی (بالایی) را به ارلن کوچکی منتقل کنید و به آن 2 گرم سدیم سولفات بدون آب اضافه کنید (برای آب گیری).

یک نوار 10 سانتی از ورقه کروماتوگرام سیلیکاژل تهیه کنید و یک لکه 1 الی 2 میلی متری از محلول ماده رنگی را طوری بر روی صفحه قرار دهید که حدود 1 و نیم سانتی متر از انتهای آن فاصله داشته باشد (برای گذاشتن لکه از لوله مویین تمیز استفاده کنید). صبر کنید تا لکه خشک شود. برای جداسازی، از حلال بنزن – استون با نسبت 7 – 3 (حجمی) مطابق توضیحات بالا استفاده کنید.

ممکن است تا هشت لکه رنگین مشاهده شود. این لکه ها به ترتیب کاهش مقدار Rf عبارتند از کاروتنها (دو لکه نارنجی)، کلروفیل a (آبی – سبز)، کلروفیل b (سبز) و زانتوفیلها (چهار لکه زرد).

 

ایمنی و کمکهای اولیه در آزمایشگاه شیمی

 

كمكهاي اوليه در آزمایشگاه شیمی

با وجود احتياطهاي لازم ممكن است در موقع كار در آزمايشگاه دست يا قسمتي از پوست بدن در اثر تماس با مواد شيميايي سوخته و يا صدمه ببينند. در اين صورت از دستورات زير استفاده كنيد.

 

سوختگي حاصل از اسيدها:

بلافاصله قسمت آسيب ديده را با آب زياد بشوييد و سپس با محلول سديم بي‌كربنات رقيق (5%) شستشو داده و بعد محل سوختگي را با كمي پارافين يا پماد mgo در گليسرين، چرب كنيد.

 

سوختگي حاصل از قلياها:

شستشو با مقدار زيادي آب و بعد شستشو با محلول (5%) آمونيم كلريد يا محلول اشباع شده بوريك اسيد و يا محلول (2%) اسيد استيك و مجددا شستشو با آب.

 

سوختگي با فسفر:

محل سوختگي را بايد با محلول (1%) سولفات مس و يا محلول (1%) نيترات نقره شستشو داد.

 

سوختگي با برم:

با مقدار زيادي آب بشوييد و سپس با گلسيرين چرب كرده و اگر ناراحتي ادامه داشت پس از مدت كمي گلسيرين را با آب گرم از روي قسمت آسيب ديده پاك نموده و از پماد مخصوص سوختگي استفاده كنيد.

 

سوختگي بر اثر شعله يا تماس با جسم داغ و يا الكتريسيته:

اگر سوختگي از نوع اول (پوست سرخ و كمي متورم شده) باشد، پماد ضد سوختگي به كار ميبريم. اگر از نوع دوم (توليد تاول در اثر سوختگي) يا نوع سوم (آسيب ديدگي قسمتهاي عمقي پوست) باشد محل آسيب ديده را فورا با محلول 1% سديم بي‌كربنات شستشو داده و از پماد سوختگي استفاده ميكنيم.

 

بريدگي:

بريدگيهايي كه در آزمايشگاه اتفاق مي افتد بيشتر در نتيجه شكستن ناگهاني ظروف شيشه اي و تماس شي شكسته با دست ميباشد. اگر بريدگي خفيف باشد، بهتر است بگذاريم براي چند ثانيه مقداري خون از بريدگي خارج شود و پس از اطمينان از اينكه ذرات شيشه در زخم نمانده از پودر پنيسيلين استفاده ميكنيم و آنرا با يك باند يا گاز تميز ميبنديم. اگر بريدگي شديدتر باشد پس از ضد عفوني كردن محل آسيب ديده به يكي از طرق فوق باند تميز روي آن قرار داده و با تنسوپلاست روي بريدگي را ميبنديم.

 

 

آتش سوزي مواد شيميايي:

بايد به سرعت مواد منفجره و ساير مواد سوختني نظير الكل و اتر را از مجاورت آتش دور نموده و سويچهاي چراغ گاز و دستگاههاي الكتريكي را قطع نمود. براي خاموش كردن آتش بهتر است از سيلندرهاي Solidcarbon Dioxide استفاده كرد.

مخلوط شن و سديم بيكربنات نيز براي خاموش كردن آتش مفيد است.

 

مسموميت با گازها:

1- دستورات مقدماتي و عمومي

استنشاق گازهاي سمي در آزمايشگاه باعث تحريك بيني و گلو و يا سرفه و سردرد ميشود و اين گونه مواد در آزمايشگاه زياد است. گاهي آثار مسموميت با بعضي گازها پس از چند ساعت آشكار ميشود، در اينگونه موارد بايد قواعد كلي زير را رعايت كرد.

الف) مسموم را به هواي آزاد انتقال داده و دكمه هاي لباس را در ناحيه سينه و گردن باز كنيد.

ب) غرغره كردن محلول سديم بيكربنات رقيق، بوييدن تنطور اكاليپتوس و نعناع و آشاميدن چاي يا شير و يا جوشانده دارچين با آب، از كمكهاي اوليه موثر ميباشد.

2- دستورات اختصاصي براي مسموميت با گازها

الف) گاز آمونياك

استنشاق بخار استيك اسيد رقيق و بعد مانند دستور سوختگي با قلياها عمل شود.

ب) گازهاي برم، كلر، فلوريدريك و كلريدريك

استنشاق بخار محلول رقيق آمونياك و بعد شستشو با آب و محلول 1% سديم بيكربنات

ج) بخارهاي اسيد نيتريك و اكسيدهاي ازت

استنشاق بخار محلول رقيق آمونياك

د) گاز هيدروژن سولفايد

شستشوي بيني و چشم با آب

 

ورود مواد به چشم

1- ورود مواد قليايي به چشم

به وسيله چشم شوي حاوي آب، چشم را بشوييد و در صورت احساس ناراحتي چند مرتبه و هر مرتبه 2 قطره روغن كرچك يا پارافين در چشم بريزيد. در صورت لزوم ميتوان با محلول 1% بوريك اسيد چشم را بشوييد.

2- ورود مواد اسيدي به چشم

 در مورد اسيدها پس از شستشوي چشم با آب، چشم را با محلول 1% سديم بيكربنات بشوييد.

 

مسموميت در اثر ورود مواد سمي به دهان

الف) اسيدها و بازها فقط داخل دهان شده باشند

به سرعت ماده را بيرون ريخته و با مقدار زيادي آب، دهان را ميشوييم و بعد در مورد اسيدها از آب آهك و در مورد بازها از آب ليمو و يا استيك اسيد 5% براي شستن دهان استفاده ميشود.

 

ب) مواد سمي فرو برده شده

1- اسيدها

آشاميدن مقدار زيادي آب و پس از آن خوراندن آب آهك و يا مخلوط MgO با آب يا شير، به هيچ وجه از داروهاي تهوع آور يا محلول بيكربنات سديم استفاده نشود.

2- بازها

آشاميدن مقدار زيادي آب و سپس سركه و يا آب ليمو و يا آب نارنج، به هيچ وجه از داروهاي تهوع آور استفاده نشود.

3- نمكهاي آرسنيك يا جيوه

خوردن يك داروي تهوع آور و بعد شير يا سفيده تخم مرغ در آب سرد و روغن كرچك

4- HF

به مريض مقدار زيادي شير بدهيد چون كلسيم موجود در شير بهترين درمان است. استفاده از آب آهك نيز مفيد است.

تهیه ی شناساگر در آزمایشگاه شیمی

1- تهیه آب آهک

5گرم اکسید کلسیم رادر150میلی لیتر آب حل کنید. این محلول کدر، شیرآهک نامیده می شود. شیر آهک را با کاغذ صافی، صاف کنید. محلول صاف شده کاملا شفاف، آب آهک است0

 

2- تهیه محلول لوگل

برای تست نشاسته، بی حرکت کردن تاژکداران و مشخص کردن هسته یک گرم یدورپتاسیم را با 25/0 گرم ید جامد مخلوط کرده و در100سی سی الکل صنعتی حل می کنیم.

 

3-تهیه محلول ید

برای رنگ آمیزی سلول های پوششی دهان و تست نشاسته 25/0 گرم ید جامد را در 100سی سی الکل صنعتی حل می کنیم.

 

4-تهیه محلول تورنسل

معرف اسیدهاو بازها

یک گرم تورنسل را در کمی آب مقطر حل کرده و حجم آنرا به 100سی سی می رسانیم.

 

5-تهیه محلول هلیانتین(متیل اورانژ)

معرف اسید و بازها

یک دهم گرم آن را در100سی سی آب مقطرحل می کنیم.

 

6-تهیه محلول فنل فتالئین

2گرم پودر فنل فتالئین رادر50سی سی الکل حل کرده با آب مقطر به100سی سی می رسانیم.

 

7-تهیه محلول نیترات نقره

برای شناخت نمک درعرق- آب معمولی و...

یک گرم پودر نیترات نقره را در100سی سی آب مقطرحل می کنیم و در شیشه های تیره نگهداری مس کنیم.

 

8-تهیه محلول گیمسا

برای رنگ آمیزی گلبول های سفید

یک گرم پودر گیمسا را با 60 سی سی گلیسیرین مخلوط نموده و به مدت 1ساعت در گرم خانه 60 درجه گرما نگهداری می کنیم. پس از خروج 66 سی سی الکل متیلیک 97درجه به به آن اضافه می کنیم. این محلول به نام محلول ذخیره گیمسا است . به هنگام استفاده 5/2سی سی از این محلول را با 3سی سی الکل متیلیک مخلوط کرده و 100 سی سی آب مقطر به آن اضافه می کنیم.

 

9- تهیه محلول فوشین قلیایی

برای رنگ آمیزی بافت های سلولزی در مدت 5 ثانیه

یک گرم فوشین قلیایی را در100سی سی الکل95 درجه حل کرده و 100سی سی آب مقطر به آن اضافه می کنیم.

 

10- تهیه محلول کارمن زاجی

برای رنگ آمیزی بافت های سلولزی در مدت 15دقیقه

برای رنگ کردن بافت های سلولزی به مدت 2-1دقیقه در یک بشر به حد اشباع زاج پتاس در آب حل می کنیم و بوسیله چراغ الکلی آن را به جوش می آوریم سپس یک گرم کارمن قرمز را در هاون سایئده به زاج در حال جوش اضافه می کنیم.10دقیقه بجوشد و پس از سرد شدن آن را با کاغذ صافی، صاف کرده و چند قطره اسید فنیک (برای جلوگیری از فساد) به آن اضافه می کنیم.

 

11- تهیه چسب نشاسته

یک گرم نشاسته را در 100سی سی آب مقطر ریخته و بهم می زنیم. سپس تا نقطه جوش حرارت داده و توسط کاغذ صافی، صاف می کنیم.

 

12- تهیه آب ژاول

برای از بین بردن ترکیبات داخل سلول

در یک شیشه مقداری پر منگنات پتاسیم ریخته و دهانه شیشه را به وسیله چوب پنبه دو سوراخه می بندیم .از یکی از سوراخ های آن بوسیله بورت شیر دار که در آن اسید کلرید ریک ریخته ایم اسید به پر منگنات اضافه می کنیم. از سوراخ دیگر چوپ پنبه لوله خمیده ای عبور می دهیم که سر دیگر آن در داخل سود سوز آور در داخل یک ارلن وارد شود. اسید با پر منگنات کلر آزاد کرده است و کلر با سود سوز آور ترکیب شده و هیپو کلرید سدیم می دهد.

 

13. تهیه محلول سولفات مس

  برای شناخت پروتئین

  یک گرم سولفات مس (کات کبود) را در cc 100 آب مقطر حل می کنیم .

 

 14. تهیه سولفات مس بدون آب

  حدود 5 گرم سولفات مس آبی رنگ را در یک لوله آزمایش ریخته و روی شعله  آنقدر حرارت می دهیم تا پودر آبی رنگ سفید شود .

 

15.تهیه محلول سود 10%

  برای تست پروتئین

10 گرم سود جامد را با ترازو وزن کرده سپس آنرا در100 آب مقطر حل کرده و خوب بهم می زنیم .

 

 16 . تهیه محلول پتاس 5%

co2 برای جذب

20 گرم پتاس جامد را وزن کرده و آن را در 400 سی سی آب حل می کنیم. 

                                             

17- تهیه اسید کلریدریک 5/0 نرمال

500سی سی آب مقطر را با 5/21 سی سی اسید کلرید ریک تجاری مخلوط می کنیم.

 

18- تهیه اسید کلریدریک 1 نرمال

100سی سی اب مقطر را با1/8 سی سی اسید کلرید ریک تجاری مخلوط می کنیم.

 

19- تهیه محلول بیکربنات پتاسیم

برای دفع Co2

5 گرم بیکربنات پتاسیم را در 100سی سی آب مقطر حل می کنیم.

 

20- تهیه آبی تولوئیدین

برای رنگ آمیزی کرو موزوم ها

نیم گرم پودر آن را در100سی سی آب مقطر حل می کنیم.

 

21- تهیه استو کار من

برای رنگ آمیزی کروموزم ها

یک گرم کارمن را در 55  سی سی آب مقطرمی جوشانیم.

 

22- تهیه برم تیمول بلو

یک گرم پودر برم تیمول را در یک لیتر آب مقطر حل کرده و یک یا دو قطره آمونیک به آن اضافه می کنیم.

 

23- تهیه بلودومتیل

نیم گرم پودر تجاری بلودومتیل را در یک لیتر آب مقطر حل می کنیم.

 

24- تهیه سبز ید

برای رنگ آمیزی بافت های سلولزی در30 ثانیه

یک گرم سبز ید را در100سی سی الکل 70 درجه حل می کنیم.

 

25- تهیه محلول گلوکز%1

یک گرم گلوکز را به مقداری آب اضافه کرده و حجم آن را به100 سی سی می رسانیم.

 

26- تهیه کشت مخمر

یک گرم پودر گلوکز را در 100 سی سی آب حل کرده یک قاشق چایخوری خمیرترش نان به آن اضافه کنید و هم بزنید.این ظرف را به مدت یک ساعت در حرارت37درجه قراردهید.

 

27- تهیه کشت پارامسی

مقداری یونجه را درظرفی خیس کرده(بهتر است یونجه ها رادریک تا دو هفته قبل از آزمایش خیس کرد و در حرارت هوای آزمایشگاه قرارداد.)

 

28- تهیه محلول پپسین

6 گرم پودر پپسین رادر150سی سی آب درون یک بشر کوچک حل می کنیم.

 

29- تهیه معرف بیوره

4 گرم سود را در500 سی سی آب مقطر حل می کنیم سپس3 گرم سولفات مس آبدار به آن اضافه کرده پس از افزودن 5 گرم یدور پتاسیم به محلول 9گرم تارتارات مضاعف سدیم و پتاسیم اضافه کرده و خوب هم زده محلول حاصله آبی رنگ است.در صورت ظاهر شدن رسوب سیاه یاقرمز محلول،خراب است.

 

30- تهیه محلول قرمز کنگو

برای رنگ کردن بافت های سلولزی

یک گرم پودر آن را در 100سی سی آب مقطر حل می کنیم.

 

31- تهیه قرمز خنثی

برای مشاهده واکوئل های درپارامسی

یک گرم پودر آن را با 100 سی سی آب مقطر مخلوط کرده و به هم زده تا محلول یک در صد بوجود بیاید .

 

32- تهیه محلول فیکساتور

برای نگهداری بافت های گیاهی در ان مقدار 150 سی سی الکل 90 درجه را با مقدار 100 سی سی فرمل 5% مخلوط کرده بعد مقدار 50 سی سی گلیسیرین به آن می افزاییم .

 

 33- تهیه محلول سبز متیل

برای رنگ کردن بافت های چوبی گیاهان در مدت 30 ثانیه

یک گرم پودر تجارتی را در 10 سی سی الکل 70 درجه حل کرده و با آب مقطر حجم آن را به 100 سی سی میرسانیم .

 

 34- تهیه محلول بندکیت کیفی

173 گرم سیترات سدیم و 100 گرم کربنانت  سدیم بی اب را در800 سی سی آب مقطر به کمک گرما حل می کنیم . در ظرف دیگری 3/17 گرم سولفات مس متبلور در 100 سی سی آب مقطر حل کرده به تدریح  به محلول سیترات کربنات اضافه می کنیم و حجم محلول را به یک لیتر می رسانیم.

 

35- تهیه فهلینک

برای شناخت گلو کز

34 گرم سولفاد مس متبلور را در مقدار کمی اب مقطر به کمک حرارت حل کرده و حجم ان را به500 سی سی می رسا نیم.

 

36- تهیه فهلینگ

 برای شناخت گلوکز

173 گرم تارتارات سدیم و پتاسیم را (نمک راشل) در کمی آب حل کرده و 100سی سی سود 15% بدان می افزائیم و حجم محلول را به 500 سی سی  می رسانیم.

 

37- تهیه محلول بیسمارک

یک گرم پودر قهوه ای بیسمارک را در100سی سی الکل 80 درجه حل می کنیم.

 

38- تهیه اسید کلریدریک رقیق

اسید کلریدریک 37% را توسط یک استوانه مدرج برداشته داخل بشر حاوی 150 سی سی آب مقطر می ریزیم . این اسید برای آزمایش هضم پروتئین می باشد .

 

39- تهیه محلول جهت شمارش گلبول های قرمز

1/. گرم نمک طعام ، 5/3 گرم سولفات سدیم ، 25/. گرم کلرور جیوه ، حجم آنها را با  آب مقطر به 100 سی سی می رسانیم .

 

40- محلول 30% کلرور کبالت

برای مشاهده اثر روزنه ها

30 گرم بلور کلرور کبالت را با 100 سی سی آب مقطر پس از حل کردن آن را صاف می کنیم .

 

41- تهیه سود رقیق

برای هضم پروتئین ها

4 گرم سود را در مقداری  آب حل کرده و حجم آن را به یک لیتر می رسانیم .

 

42- تهیه معرف تالن (محلول نیترات نقره آمونیاکی)

به 3 سی سی محلول نیترات نقره 3 قطره محلول سود اضافه کنید . رسوب قهوه ای  رنگ  Hg₂o  تولید می شود .سپس محلول آمونیاک به آن بیافزایید تا رسوب حل شود .

 

43- تهیه معرف شیف

1/. گرم فوشین در 100 سی سی آب مقطر به این محلول گاز  so₂ سولفیت سدیم و کمی  Hcl  اضافه می کنیم .

 

44- تهیه محلول لوکاس

برای تشخیص انواع الکل ها

17گرم کلرید روی بدون آب مذاب شده را در 5/11 میلی لیتر محلول  Hcl  37% حل کرده و به هم زده و بعد در دسیکاتور خشک شده و دیگر بخارات اسید از آن بلند نشود استفاده می کنیم.

اندازه گیری آهن

مقدمه :

نحوه کار با دستگاه اسپکتروفوتومتر

بطور کلی هر روش یا دستگاهی که بررسی برهمکنش نور با ماده بپردازد به روشهای اسپکتروسکوپی یا طیف سنجی مربوط می شود.

روشهای اسپکتروفوتومتری بسیار وسیع هستند که در هر تکنیک به بررسی برهم کنش یک بخش از نور یا امواج الکترومغناطیس با ماده پرداخته می شود.

اما برای استفاده از تکنیک اسپکتروفوتومتری مانند طیف سنجی ماورای بنفش – مرئی ، برای اندازه گیری کمی باید در ابتدا یک منحنی کالیبراسیون رسم گردد. به عنوان مثال چنانچه بخواهیم از اسپکتروسکوپی ماورای بنفش – مرئی برای اندازه گیری غلظت یک یون مجهول مثلاً یون آهن 3 استفاده کنیم باید در ابتدا چند محلول کاملاً معلوم از این یون تهیه شود و منحنی غلظت بر حسب میزان جذب برای این یون رسم گردد. این منحنی کالیبراسیون نام دارد.

سپس با اندازه گیری میزان جذب نمونه ی مجهول و بر اساس منحنی کالیبراسیون می توان به غلظت نمونه ی مجهول دست یافت.

۱الف) واکنش فلزها و از جمله آهن با سولفوریک اسید رقیق و غلیظ متفاوت است. آهن با سولفوریک اسید رقیق گاز هیدروژن تولید می‌کند در حالی که در واکنش با سولفوریک اسید غلیظ گاز SO₂ تولید می‌کند:

واکنش آهن با اسید رقیق:

2 Fe + H₂SO₄ --> H₂ + Fe₂SO₄

واکنش آهن با اسید غلیظ:

 Fe + H₂SO₄ + 2 H⁺ --> Fe²⁺ + SO₂ + 2 H₂O

الف) هر نمکی می‌تواند اسید هم خانواده خود را جذب نماید. برای نمونه سولفاتها می‌توانند سولفوریک اسید را جذب کنند، کلریدها هیدرو کلریک اسید را و...

الف) اسپکتروسکوپی فرابنفش-مرئی:

يک دستگاه اسپکتروفتومتر فرابنفش–مرئي شامل يک منبع نوري، يک تکفام‌ساز و يک آشکارساز است.

١) منبع نوري بیشتر يک لامپ دوتريم است که در ناحيه فرابنفش طيف الکترومغناطيسي تابش مي‌کند. لامپ تنگستن، براي طولهاي موجهاي ناحيه مرئي از طيف الکترومغناطيسي به کار مي‌رود.

٢) تکفام‌ساز يک شبکه پراش است و نقش آن، پخش کردن پرتو نوري به طول موجهاي تشکيل‌شده از آن است. مجموعه‌اي از روزنه‌ها، طول موج مورد نظر را بر روي سلول نمونه متمرکز مي‌سازند.

٣) آشکارساز: نوري که از درون سلول نمونه مي‌گذرد، به آشکارساز مي‌رسد و در آن جا شدت نور عبوري (I) ثبت مي‌شود. آشکارساز، بیشتر يک لوله تکثيرکننده فوتون است، ولي در دستگاههاي جديد از فتوديودها نيز استفاده مي‌شود. در يک دستگاه دو پرتوي، نور ساطع‌شده از منبع نوري به دو پرتو تقسيم مي‌شود: پرتو نمونه و پرتو شاهد. وقتي نمونه‌اي در مقابل پرتو شاهد نباشد، نور آشکار شده معادل شدت نور ورودي به نمونه است.(I₀)
سلول نمونه بايد از ماده‌اي ساخته شده باشد که نسبت به تابش الکترومغناطيس به کار رفته، شفاف باشد. سلولهاي به کار رفته براي ناحیه مرئي طيف الکترومغناطيس، از جنس شيشه يا پلاستيک هستند. اما براي طيف‌گيري در ناحيه فرابنفش نمي‌توان از شيشه يا پلاستيک استفاده کرد، زيرا نور فرابنفش را جذب مي‌کنند. در عوض، از سلولهايي از جنس کوارتز بايد استفاده شود که تابش اين ناحيه را جذب نمي‌کنند.

محدودیت دستگاه شرح داده شده:

دستگاهي که شرح آن رفت، فقط براي کار در يک طول موج مناسب است؛ اگر طيف جامعي مورد نظر باشد، به يک سيستم مکانيکي جهت چرخش تکفام‌ساز و پویش تمامي طول موجها نیاز خواهد بود. اين نوع سيستم آهسته کار مي‌کند و بنا بر اين، زمان قابل توجهي براي ثبت يک طيف مورد نياز است.

 

 

اسپکتروفتومترهاي جديد

تغيير جديد در راستاي بهبود کيفيت اسپکتروفتومترهاي قديمي، ساخت اسپکتروفتومترهاي رديف ديودي است. يک رديف ديود، شامل مجموعه‌اي از آشکارسازهاي فوتوديود است که در کنار يکديگر بر روي يک بلور سيليسيم قرار گرفته‌اند. هر ديود، برای ثبت نوار باريکي از طيف طراحي شده است. اين ديودها به گونه‌اي به يکديگر مربوط شده‌اند که سراسر طيف در يک زمان ثبت مي‌شود.
اين نوع آشکارساز هيچ قسمت متحرکي ندارد و مي‌تواند طيفها را به‌ سرعت ثبت کند. افزون بر اين، خروجي آن به يک رایانه داده می‌شود که می‌تواند به پردازش داده‌ها بپردازد. ولی از آنجایی که شمار فتوديودها محدودند، بنا بر این قدرت تفکيک اندکی کاهش مي‌یابد.البته استفاده از روش طيف سنجي UV - vis هنگامی مفيد است که نمونه رنگي باشد.روش اسپكتروسكوپي جذب اتمي (AAS) بر اندازه‌گيري جذب يك خط طيفي با استفاده از يك منبع تابشي – كه خط تيزي نشر مي‌كند - متكي است. هرچه خط نشري توليدي باريكتر باشد براي اندازه‌گيري نمونه‌ها بهتر است. حتي تيزترين خط نشري كه به وسيله‌ي يك اسپكترومتر نوين قابل توليد باشد داراي پهناي معيني مي‌باشد.

اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه اسپكتروسكوپ

منبع نور :

معمولا لامپ نرنست  ( Nernst ) است که شامل میله ای است که مخلوط اکسید زیرکونیوم ( Zirconium ) ، ایتریوم( Yttrium )  و اربیوم ( Erbium )  می باشد و به کمک برق تا  oC 1500   ۫گرم می شود .

محل نمونه :

چون شیشه و کوارتز تقریبا همه طول موجهای ناحیه مادون قرمز را جذب می کنند ، از این رو نمی توانند به عنوان سل و یا به عنوان منشور دستگاه  IR  بکار روند. نمک های هالوژنه به این منظور بکار میروند و معمولا از کلرور سدیم به عنوان سل نمونه استفاده می شود ، که چون در آب حل می گردد ، اگر نمونه حاوی آب باشد ، از سل  AgCl و یا برخی از پلیمرها استفاده می گردد.

منو کروماتور :

باید از جنس نمکهای هالوژنه باشد.

دتکتور :

از نوع حرارتی و ترموکوپل است . میزان انرژی نورانی جذب شده متناسب با میزان حرارت ایجاد شده می باشد .

رکوردر ( ثبات ) :

طیف نمونه را رسم می کند.

هدف از انجام آزمایش :

اندازه گیری غلظت آهن موجود در نمونه مجهولی توسط دستگاه اسپکتروسکوپی

وسایل مورد نیاز برای انجام آزمایش : بالن – پی پت – ترازو – دستگاه اسپکتروسکوپی – پوآر

مواد مورد نیاز : تیوسیانات پتاسیم ، یون آهن ، اسید نیتریک ، آب مقطر

روش انجام آزمایش : ابتدا هریک از گروهها محلولهای مورد نیاز آزمایش یعنی محلول آهن با غلظت 10ppm و تیوسولفات پتاسیم M 1/0 و همچنین محلول اسید نیتریک با غلظت M 4 تهیه می کنیم سپس با توجه به جدول ارائه شده محلولها را به ترتیب داخل بالونها ریخته و آن را به حجم ml50 می رسانیم. باید توجه داشته باشیم که بعد از شستن بالن ها حتما آنها را با آب مقطر کر دهیم . همچنین قبل از استفاده از پی پت برای هرمحلول توجه داشته باشیم که پی پت را درون محلول دیگری وارد نکنیم. همچنین به دلیل اینکهاز 6 بالن استفاده می کنیم باید حتما روی هر بالن شماره آن را درج کنیم . بعد محلول شماره صفر را درون سل ریخته و بعد جذب آن راصفر می کنیم بعد محلول شماره یک را درون سل می ریزیم و جذب آن را اندازه می گیریم به همین ترتیب برای محلولهای دیگر نیز جذب را اندازه می گیریم به این ترتیب نموداری رسم نموده که درآن جذب برحسب غلظت است یعنی نموداری که در آن وابسته برحسب مستقل می باشد و در آن غلظت نمونه مجهول از روی نمودار بدست می آید.

انجام محاسبات :

تهیه محلول M4 اسیدنیتریک

از رابطه n₁v₁ = n₂v₂ استفاده می کنیم که در آن نرمالیته  به دلیل آن که ظرفیت اسید برابر 1 است برابر مولاریته می شود و همچنین نرمالیته اسید غلیظ از این رابطه بدست می آید

N = 10 ad/E

با جایگذاری در رابطه بالا باید حجم ml69/27 از اسید غلیظ را برداشته و درون بالن به حجم برسانیم.

برای تهیه M1/0 تیوسیاناتپتاسیم :

برای تهیه این محلول می توان به روش زیر عمل کرد .

باید مقدار gr97/0 از تیوسیانات سدیم را برداشته و درون بالن ریخته و مقداری آب ریخته و حل نموده و به حجم می رسانیم

تهیه محلول آهن : برای تهیه این محلول نیز مانند راه حل بالا عمل می کنیم . که در این محلول باید مقدار gr05/0 از نمک آهن را برداشته و در درون بالن ml500 حل کردهو به حجم می رسانیم.

تنظیم جدول مربوطه :

5	4	3	2	1	0
10ml مجهول	10	5	3	1	0	FE^3+
10	10	10	10	10	10	KSCN0/1ml
5	5	5	5	5	5	HNo3 4M
50	50	50	50	50	50	Vtot
؟	2	1	6/0	2/0	0	C
001/0	034/0	183/0	006/0	072/0	0	A

 

 

 

 

 

رسم نمودار

نتیجه گیری :

با توجه به جذبی که دستگاه نشان داد و از روی نموداری که رسم کردیم به این نتیجه رسیدیم که غلظت محلول مجهول برابر................................. است .

منابع:

1.     جزوه شیمی تجزیه دستگاهی

2.     سایت دانشنامه رشد

نحوه کار با دستگاه اسپکتروفوتومتر

بطور کلی هر روش یا دستگاهی که ه بررسی برهمکنش نور با ماده بپردازد به روشهای اسپکتروسکوپی یا طیف سنجی مربوط می شود.
روشهای اسپکتروفوتومتری بسیار وسیع هستند که در هر تکنیک به بررسی برهم کنش یک بخش از نور یا امواج الکترومغناطیس با ماده پرداخته می شود.
اما برای استفاده از تکنیک اسپکتروفوتومتری مانند طیف سنجی ماورای بنفش – مرئی ، برای اندازه گیری کمی باید در ابتدا یک منحنی کالیبراسیون رسم گردد. به عنوان مثال چنانچه بخواهیم از اسپکتروسکوپی ماورای بنفش – مرئی برای اندازه گیری غلظت یک یون مجهول مثلاً یون آهن 3 استفاده کنیم باید در ابتدا چند محلول کاملاً معلوم از این یون تهیه شود و منحنی غلظت بر حسب میزان جذب برای این یون رسم گردد. این منحنی کالیبراسیون نام دارد.
سپس با اندازه گیری میزان جذب نمونه ی مجهول و بر اساس منحنی کالیبراسیون می توان به غلظت نمونه ی مجهول دست یافت.

۱الف) واکنش فلزها و از جمله آهن با سولفوریک اسید رقیق و غلیظ متفاوت است. آهن با سولفوریک اسید رقیق گاز هیدروژن تولید می‌کند در حالی که در واکنش با سولفوریک اسید غلیظ گاز SO₂ تولید می‌کند:

واکنش آهن با اسید رقیق:

2 Fe + H₂SO₄ --> H₂ + Fe₂SO₄

واکنش آهن با اسید غلیظ:

 Fe + H₂SO₄ + 2 H⁺ --> Fe²⁺ + SO₂ + 2 H₂O

 

 

 

۲الف) هر نمکی می‌تواند اسید هم خانواده خود را جذب نماید. برای نمونه سولفاتها می‌توانند سولفوریک اسید را جذب کنند، کلریدها هیدرو کلریک اسید را و...

 

٣الف) اسپکتروسکوپی فرابنفش-مرئی:
به طور کلي هر روش يا دستگاهي که به بررسي برهم‌کنش نور با ماده بپردازد به روشهاي اسپکتروسکوپي يا طيف سنجي مربوط مي‌شود. روشهاي اسپكتروفوتومتري بسيار گسترده‌اند و در هر روش به بررسي برهم‌کنش يک بخش از نور يا امواج الکترومغناطيس با ماده پرداخته مي‌شود. براي اندازه‌گيري کمي با اسپكتروفوتومتري، در ابتدا بايد يک منحني کاليبراسيون رسم گردد. برای مثال چنانچه بخواهيم از اسپکتروسکوپي UV-Vis براي اندازه‌گيري غلظت يک يون ماننديون آهن III استفاده کنيم، بايد در ابتدا چند محلول معلوم از اين يون تهيه شود و منحني غلظت بر حسب ميزان جذب براي اين يون رسم گردد. اين منحني کاليبراسيون نام دارد. سپس با اندازه‌گيري ميزان جذب نمونه مجهول و بر اساس منحني کاليبراسيون مي‌توان به غلظت نمونه مجهول پی برد.

يک دستگاه اسپکتروفتومتر فرابنفش–مرئي شامل يک منبع نوري، يک تکفام‌ساز و يک آشکارساز است.
١) منبع نوري بیشتر يک لامپ دوتريم است که در ناحيه فرابنفش طيف الکترومغناطيسي تابش مي‌کند. لامپ تنگستن، براي طولهاي موجهاي ناحيه مرئي از طيف الکترومغناطيسي به کار مي‌رود.
٢) تکفام‌ساز يک شبکه پراش است و نقش آن، پخش کردن پرتو نوري به طول موجهاي تشکيل‌شده از آن است. مجموعه‌اي از روزنه‌ها، طول موج مورد نظر را بر روي سلول نمونه متمرکز مي‌سازند.
٣) آشکارساز: نوري که از درون سلول نمونه مي‌گذرد، به آشکارساز مي‌رسد و در آن جا شدت نور عبوري (I) ثبت مي‌شود. آشکارساز، بیشتر يک لوله تکثيرکننده فوتون است، ولي در دستگاههاي جديد از فتوديودها نيز استفاده مي‌شود. در يک دستگاه دو پرتوي، نور ساطع‌شده از منبع نوري به دو پرتو تقسيم مي‌شود: پرتو نمونه و پرتو شاهد. وقتي نمونه‌اي در مقابل پرتو شاهد نباشد، نور آشکار شده معادل شدت نور ورودي به نمونه است.(I₀)
سلول نمونه بايد از ماده‌اي ساخته شده باشد که نسبت به تابش الکترومغناطيس به کار رفته، شفاف باشد. سلولهاي به کار رفته براي ناحیه مرئي طيف الکترومغناطيس، از جنس شيشه يا پلاستيک هستند. اما براي طيف‌گيري در ناحيه فرابنفش نمي‌توان از شيشه يا پلاستيک استفاده کرد، زيرا نور فرابنفش را جذب مي‌کنند. در عوض، از سلولهايي از جنس کوارتز بايد استفاده شود که تابش اين ناحيه را جذب نمي‌کنند.

محدودیت دستگاه شرح داده شده:
دستگاهي که شرح آن رفت، فقط براي کار در يک طول موج مناسب است؛ اگر طيف جامعي مورد نظر باشد، به يک سيستم مکانيکي جهت چرخش تکفام‌ساز و پویش تمامي طول موجها نیاز خواهد بود. اين نوع سيستم آهسته کار مي‌کند و بنا بر اين، زمان قابل توجهي براي ثبت يک طيف مورد نياز است.

اسپکتروفتومترهاي جديد
تغيير جديد در راستاي بهبود کيفيت اسپکتروفتومترهاي قديمي، ساخت اسپکتروفتومترهاي رديف ديودي است. يک رديف ديود، شامل مجموعه‌اي از آشکارسازهاي فوتوديود است که در کنار يکديگر بر روي يک بلور سيليسيم قرار گرفته‌اند. هر ديود، برای ثبت نوار باريکي از طيف طراحي شده است. اين ديودها به گونه‌اي به يکديگر مربوط شده‌اند که سراسر طيف در يک زمان ثبت مي‌شود.
اين نوع آشکارساز هيچ قسمت متحرکي ندارد و مي‌تواند طيفها را به‌ سرعت ثبت کند. افزون بر اين، خروجي آن به يک رایانه داده می‌شود که می‌تواند به پردازش داده‌ها بپردازد. ولی از آنجایی که شمار فتوديودها محدودند، بنا بر این قدرت تفکيک اندکی کاهش مي‌یابد.

البته استفاده از روش طيف سنجي UV - vis هنگامی مفيد است که نمونه رنگي باشد.

روش اسپكتروسكوپي جذب اتمي (AAS) بر اندازه‌گيري جذب يك خط طيفي با استفاده از يك منبع تابشي – كه خط تيزي نشر مي‌كند - متكي است. هرچه خط نشري توليدي باريكتر باشد براي اندازه‌گيري نمونه‌ها بهتر است. حتي تيزترين خط نشري كه به وسيله‌ي يك اسپكترومتر نوين قابل توليد باشد داراي پهناي معيني مي‌باشد.

اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه اسپكتروسكوپ

منبع نور :
معمولا لامپ نرنست  ( Nernst ) است که شامل میله ای است که مخلوط اکسید زیرکونیوم ( Zirconium ) ، ایتریوم( Yttrium )  و اربیوم ( Erbium )  می باشد و به کمک برق تا  oC 1500   ۫گرم می شود .

محل نمونه :
چون شیشه و کوارتز تقریبا همه طول موجهای ناحیه مادون قرمز را جذب می کنند ، از این رو نمی توانند به عنوان سل و یا به عنوان منشور دستگاه  IR  بکار روند. نمک های هالوژنه به این منظور بکار میروند و معمولا از کلرور سدیم به عنوان سل نمونه استفاده می شود ، که چون در آب حل می گردد ، اگر نمونه حاوی آب باشد ، از سل  AgCl و یا برخی از پلیمرها استفاده می گردد.

منو کروماتور :
باید از جنس نمکهای هالوژنه باشد.

دتکتور :
از نوع حرارتی و ترموکوپل است . میزان انرژی نورانی جذب شده متناسب با میزان حرارت ایجاد شده می باشد .

رکوردر ( ثبات ) :
طیف نمونه را رسم می کند.

گاز کروماتوگرافی ( GC )

از گاز کروماتوگرافی ( GC ) براي شناسايي و تعيين مقدار انجام مي شود. در گاز کروماتوگرافی ( GC ) با دو فاز سر و كار داريم : فاز ساكن و فاز متحرك ، فاز متحرك يك گاز است و فاز ساكن مي تواند مايع يا جامد باشد. فاز متحرك هيچ نقشي در جداسازي ندارد و يكي از تفاوت هاي GC با HPLC همين موضوع است. در HPLC فاز متحرك يك مايع است كه در جداسازي نقش دارد. تنها نقش فاز متحرك در GC حمل مواد به جلو و خارج كردن آنها از ستون است. به همين دليل كيفيت جداسازي در HPLC بهتر است از GC.

ابتدا نمونه را توسط سرنگ داخل injector تزريق مي كنيم. نمونه پس از ورود به injector به بخار تبديل شده و با فاز متحرك مخلوط شده ، وارد ستون مي شود. نمونه جذب ستون مي شود و در زمانهاي مختلف به وسيله گاز بي اثر از ستون بيرون مي آيد و وارد دتكتور مي شود. ستون قلب دستگاه است زيرا عمل اصلي كه جداسازي است در آنجا انجام مي شود. دتكتور شناسايي را انجام مي دهد جهت شناسايي مواد با GC از Rt) Retention time ) استفاده مي شود. Retention time  زماني است كه طول مي كشد تا جسم از دتكتور بيرون بيايد ، يعني از زمان تزريق نمونه تا زمان ظاهرشدن پيك ها روي دستگاه كه براي يك ماده تحت شرايط ثابت ، مقداري ثابت است. بنابراين از مقايسه Rt معلوم با Rt مجهول، مي توان اجزاي موجود در مجهول را تشخيص داد.
اگر مجهول و استاندارد، Rt يكسان داشتند، مي توان نتيجه گرفت كه هر دو نمونه يكي هستند.

پارامتر مهم ديگر در GC ، سطح زير منحني ( AUC ) است. ركوردر به ما كروماتوگرامي مي دهد كه در راس هر پيك Rt  را مي نويسد و AUC مربوط به آن را هم مي دهد پس كروماتوگرام حاوي دو اطلاع ارزنده است:
1- Rt براي شناسايي كيفي جسم
2- AUC براي تعيين مقدار كمي جسم

گاز حامل : يك گاز بي اثر است (He,( H2, N2 ، He از همه بهتر است ولي چون گران است كاربرد كمي دارد. نگهداري H2 هم خطرناك است چون قابليت انفجار دارد، بنابراين N2 استفاده مي شود.

اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه GC

 

سليندر:
حاوي گاز حامل، در بیشتر دستگاه ها از گاز ازت كه گازي خنثي، ارزان و در دسترس است استفاده مي شود.

فلومتر:
توسط اين قسمت از دستگاه تنظيم فشار گاز حامل صورت مي گيرد كه اگر نمونه سريعتر بيرون بيايد ممكن است دو پيك روي هم بيفتند. هر چه فلو بيشتر باشد، مواد سريعتر از ستون خارج مي شوند. . فلو برحسب ml/min است. ( در كار با GC بايد نوع گاز حامل و flue آن ذكر شود ).

محل تزريق نمونه  (injector) :
دو محل تزريق در بالا و پائين وجود دارد كه نمونه را به سرعت و توسط يك سرنگ در يكي از آنها بسته به اينكه از ستون بالايي يا پاييني استفاده مي كنيم تزريق مي كنيم. با GC مي توان نمونه هاي با حجم هاي بسيار كم تا دهم هاي ميكروليتر را اندازه گيري نمود.

ستون (column) :
ستون نقش اصلي جداسازي را به عهده دارد كه از جنس هاي مختلف مي باشد:ستون فولادي،مسی ، شيشه ايی يا استيل باشد كه سخت پر مي شود و حتما بايد توسط كارخانه سازنده پر شود.
ستون مسي انعطاف پذيري خوبي دارد و به راحتي پر مي شود زيرا مي توان آن را به صورت مستقيم پر كرد و سپس به صورت مارپيچ در آورد. ولي عيب آنها تشكيل اكسيد مس در جداره ستون مي باشد كه مي تواند برخي واكنش ها را كاتاليز كند. در حالي كه ستون هاي فولادي اين عيب را ندارند.
ستون هاي شيشه اي كه مزيت آنها اين است كه داخل آنها را مي توانيم مشاهده كنيم بنابراين اگر هوا گرفته باشد متوجه مي شويم و عيب آنها شكننده بودنشان است. ستون هاي فولادي خيلي مستحكمند و بايد در كارخانه بصورت مارپيچ در آيند ، بنابراين پركردن آنها مشكل است و احتياج به دستگاه ويبراتور داريم. يك ويژگي مهم و تاثير گذار در ستون ها پلاريته آنهاست كه توسط كارخانه سازنده مشخص مي شود كه بر اين اساس مي توان ستون هاي مشابه را انتخاب كرد.
براي فاز مايع از خاكه آجر يا chromosorb p كه بي اثر است براي تثبيت مايع استفاده مي كنند آن را پر مي كنند. و مايع ديرجوش را روي خاكه آجر مي دهند و تثبيت مي كند كه معمولا پارافين يا silicon greas است.

Oven :
Oven قسمت گرم كننده است. سه قسمت از دستگاه بايد گرم شوند. Injector, oven و Column (كه دو عدد هستند و در بالا و پايين oven قرار مي گيرند) و نيز Detector قرار دارد.
دماي ستون بايد چند درجه بالاتر از نقطه جوش دير جوش ترين جزء موجود در نمونه باشد مثلا اگر بالاترين نقطه جوش ۱۵۰ درجه سانتیگراد باشد، دماي ستون ۱۷۰ درجه سانتیگراد باشد. دماي injector بايد چند درجه بالاتر از ستون و دماي دتكتور هم چند درجه بالاتر از injector باشد با ستون با دو برنامه دمايي مي توان كار كرد: اگر روش كار ايزوترمال باشد به oven يك دماي ثابت مي دهيم اما اگر به روش برنامه ريزي كار كنيم ، بايد به آن برنامه دمايي بدهيم.

روش Isothermal :
در اين روش با يك دماي ثابت كار مي كنيم  ، بيشتر زماني استفاده مي شود كه در نمونه فقط يك ماده مورد شناسايي وجود دارد يا اگر چند ماده وجود دارد، نقطه جوش آنها نزديك به هم است.

روش برنامه ريزي دمايي (programming) :
در مواقعي استفاده مي شود كه مواد موجود در نمونه Range وسيعي از نقطه جوش دارند و اگر ابتدا دماي Oven را بالاتر از نقطه جوش دير جوش ترين ماده قرار دهيم ، مواد با نقطه جوش كمتر تجزيه خواهد شد و نمي توان آنها را شناسايي كرد. بنابراين طوري دما را تنظيم مي كنيم كه با سرعت مشخصي از چند درجه بالاتر ازمواد به ترتيب نقطه جوش از ستون بيرون مي آيند يعني هر چه تعداد كربن هاي ماده بيشتر باشد ديرتر بيرون مي آيند و پيك آنها ديرتر ظاهر مي شود. وقتي نمونه اي حاوي چند جزء با طيف وسيع BP است نمي توان از روش ايزوترمال استفاده كرد زيرا با داشتن فقط يك دما ، ممكن است يك جزء خيلي سريع بيرون بيايد و از دست برود يا بيرون آمدن آن ، زمان طولاني ببرد. بنابراين بايد از روش Programming استفاده كنيم ، يعني از چند Oven استفاده كرده و به هر يك ، دمايي خاص مي دهيم.

آشكارساز (Detector) :
دتكتور بر اساس پاسخي كه مي دهد به دو دسته تقسيم مي شود :
دتكتور انتگرالي ، كه پاسخ انتگرالي مي دهد. كه امروزه منسوخ شده است.
دتكتور تفكيكي ، پاسخ اين دتكتور به اين صورت است كه وقتي گاز حامل به تنهايي مي آيد، خط صاف و وقتي به همراه نمونه مي آيد يك پيك مي دهد.
يكي از دتكتورهاي تفكيكي كه در GC استفاده مي شود Flame Ionization Detector (FID)مي باشد. نمونه ها بعد از اينكه از ستون خارج مي شوند وارد دتكتور مي شوند. نمونه ها در شعله دتكتور مي سوزند و ايجاد يون و الكترون مي كنند. آنچه مهم است الكترون هايي است كه توليد مي شوند. الكترونها جرياني را كه از FID عبور مي كند افزايش مي دهند و غلظت نمونه متناسب با افزایش ميزان جريان است.
براي تشكيل شعله از سوخت هيدروژن با اكسيژن هوا استفاده مي شود. براي تامين اكسيژن هم از كپسول هوا استفاده مي شود.
نشانه روشن بودن دستگاه دتكتور اين است كه بخار آب از آن خارج شود. FID حساسيت بالايي دارد و عيب آن تخريب نمونه است. ( نوع دتكتور هم بايد در كار تحقيقاتي ذكر شود ).
 
رکوردر :
چگونگي تنظيم دما:
دماي ستون را چند درجه بالاتر از نقطه جوش دير جوشترين جزء موجود در نمونه قرار مي دهيم و دماي injector را چند درجه بالاتر از ستون و نيز دماي دتكتور نيز چند درجه بالاتر از دماي injector قرار مي دهيم.

برنامه دمايي ايزوترمال:
70 درجه سانتیگراد  = oven
۹0 درجه سانتیگراد  = Injector
۱۰۰ درجه سانتیگراد = Detector
mLit = مقدار تزريق   

علت استفاده از استاندارد داخلي :
در روش AUC بايد از استاندارد داخلي استفاده كنيم كه علت استفاده از استاندارد داخلي ، حذف خطاي حاصل از حجم تزريق مي باشد. زيرا حجم تزريق كم است و احتمال اشتباه زياد مي باشد و براي استفاده كمي و حذف اين خطا از يك استاندارد داخلي كه از لحاظ ساختمان شيميايي نزديك به نمونه باشد استفاده مي كنيم مثلا براي تعيين مقدار اتانول ، از بوتانول به عنوان استاندارد داخلي استفاده مي كنيم زيرا از لحاظ ساختمان شيميايي نزديك به نمونه اتانول است بنابراين ضمن اينكه پيك هاي مربوط به هر كدام جدا مي باشد، خيلي هم از هم فاصله ندارند.